DB52T 953-2014 贵州辣椒品种SSR 标记鉴定技术规程 12页

ICS65.020.01B21DB52贵州省地方标准DB52/T953—2014贵州辣椒品种SSR标记鉴定技术规程2014-10-30发布2014-11-30实施贵州省质量技术监督局发布发布贵州省农业委员会发布\n\nDB52/T953—2014目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14试剂..............................................................................15辣椒品种鉴定的SSR标记（见附录A）.................................................26分析步骤..........................................................................27结果判定..........................................................................3附录A（资料性附录）辣椒品种鉴定SSR标记的PCR引物..................................5I\n\n学兔兔www.bzfxw.comDB52/T953—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。请注意：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由贵州省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：贵州省辣椒研究所、贵州省标准化院、贵州省旱粮研究所。本标准主要起草人：何建文、付文婷、朱云乐、杨文鹏。本标准由贵州省辣椒研究所负责解释。II\n\nDB52/T953—2014贵州辣椒品种SSR标记鉴定技术规程1范围本规程规定了辣椒品种SSR标记鉴定方法。本标准适用于贵州辣椒品种及种质资源鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1bp-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。4试剂以下所用试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂，水符合国家GB/T6682中规定的一级水标准。4.11M三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl称量121.1gTris置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调pH值至8.0，加ddH2O定容至1L。4.20.5M乙二胺四乙酸二钠EDTA称取186.1gEDTA置于1L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH调节pH值至8.0，加ddH2O定容至1L。4.35×TBE缓冲液称取54gTris-base、27.5g硼酸（H3BO3）、3.72gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)加ddH2O定容至1L。4.4CTAB提取液1\nDB52/T953—2014分别量取10ml1mol/LTris-HCL、30ml0.5mol/LEDTA、42ml5mol/LNaCl、PVP2g、CTAB2g，加水溶解后定容至100ml，使用前加入1ml巯基乙醇。4.56%变性测序胶称取460g尿素，57g丙烯酰胺，3g甲叉双丙烯酰胺，200ml5×TBE溶液，再加少量ddH2O，短暂加热（≯37℃），搅溶溶解，滤纸过滤，加水定容至1000ml。4.6固定液量取无水乙醇75ml，冰醋酸3.5ml，加ddH2O定容至1L。4.7染色液称量2g硝酸银溶于1LddH2O。4.8显影液称量15gNaOH，4ml甲醛混合均匀，加ddH2O至1L。4.9终止液称量7.5gNa2CO3溶于1LddH2O中。4.10仪器设备分析天平，纯水仪，制冰机，台式低温冷冻离心机，移液器，PCR仪，凝胶成像系统，电泳仪，核酸蛋白分析仪，垂直电泳槽，水平电泳槽，超低温冰箱，冰箱，液氮罐，数码相机，电脑，等等。5辣椒品种鉴定的SSR标记（见附录A）Hpms1-139、CA514621、CA515055、BM59622、BM61910、CP10061、AF208834、hpms1-274、CM10、Hpms1-43、CA526211、CA847460、Hpms1-281、Hpms2-13、Hpms1-3、Hpms2-41、CA514272、GP1078、GP20036、hpms1-214、CA515649、CA517699、CAN130829、Hpms1-69、BM61461、CB164897、Hpms2-45、CA523558、CA525390、Hpms2-281。6分析步骤6.1样品采集采集辣椒植株顶部幼嫩叶片1g-2g，叶片样品用牛皮纸包装，冰盒携带，4℃保存。6.2辣椒基因组DNA提取6.2.1用1.5ml离心管盖取幼苗叶片（约12mg-15mg），置于冰上。6.2.2加抽提液100μl，研磨成浆。6.2.365℃水浴20min-40min，其间颠倒离心管两次。6.2.4取出微离心管，放置5min-10min，冷至室温。2\nDB52/T953—20146.2.5加入100μl的苯酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1），上下颠倒混合5min，3200rpm-12000rpm离心10min。6.2.6转移上清至另一1.5ml离心管，加入7.5μl5mol/LNaCl，用100μl无水乙醇（冰冻或室温）沉淀DNA。6.2.7短暂离心，除去乙醇，用75%乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃乙醇，自然干燥至没有乙醇气味。6.2.8加入200μl灭菌ddH2O或TE(pH=8.0)，4℃溶解DNA。6.2.9-20℃储存。6.3PCR（聚合酶链式反应）扩增体系6.3.1SSR反应体系2+反应总体系为25μL，其中包括20ng模板DNA，2.5mmol/LMg，0.2mmol/LdNTPs，1UTaqDNA聚合酶，每条引物400nmol/L，10×Buffer（缓冲液）。6.3.2PCR扩增程序94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃-60℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。6.4电泳检测6.4.1制备6%聚丙烯酰胺变性测序胶取30ml6%的聚丙烯酰胺变性凝胶，再加入10%过硫酸铵200μl，四甲基乙二胺40μl，混合均匀，将凝胶灌入玻璃板后，立刻插入梳子。6.4.2电泳将制好的凝胶板插入电泳槽，设45℃，额定功率70W-75W，先预电泳30min，然后将检测样品加入槽内，设50℃，在额定功率75W-80W下，电泳1-2个小时，当指示剂二甲苯青距离玻璃板底部约1cm左右时，结束电泳。6.5电泳结果观察记录6.5.1银染显影将凝胶浸入固定液，轻摇20min，取出用ddH2O清洗2次；再将凝胶放入染色液中轻摇30min，取出用ddH2O清洗2次；紧接着将凝胶放入显影液中，轻摇至DNA条带清晰出现为止，将出现清晰条带胶板转至终止液中，轻摇2min-3min，然后取出，用清水洗净，晾干。6.5.2数据记录将电泳凝胶放在灯箱下观察，同一位置清晰出现的条带记为“1”，没有条带记为“0”，缺失的记为“.”，由此生成“0”、“1”和“.”原始矩阵。7结果判定3\nDB52/T953—2014用分子标记差异值≥2作为品种（或品系、自交系）的特异性判定标准，亦即如果两个品种（或品系、自交系）在两个或两个以上SSR标记位点具有不同等位，则可以判定为不同品种（或品系、自交系）。4\nDB52/T953—2014AA附录A（资料性附录）辣椒品种鉴定SSR标记的PCR引物序号标记名称染色体引物序列1Hpms1-1391F：CCAACAGTAGGACCCGAAAATCCR：ATGAAGGCTACTGCTGCGATCC2hpms1-2141F：TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAGR：GGCAGTCCTGGGACAACTCG3CA5146212F：GTCGAACAAAATGGGGTTTGR：GCTGGAGAGTGCTGGTGG4CA5156492F：TCTCCAATTTCCATTCGGAGR：TAATCGCATTTGCGAACTTG5CA5142722F：ATCTATTTTCCTCCGGCGACR：CGGTAAGCTGCCTTGATCTC6CA5150552F：TAATCGAGCGGTAGATTCGGR：TAAGTGGAGGTGCCCTTCTG7BM596623F：CGTCTTTCACTTGTCTTTTGTTCR：AGTGGGTTCACTGACTTGGG8CA5176993F：ACGCCAAGAAAATCATCTCCR：CCATTGCTGAAGAAAATGGG9BM619103F：ATTGTGATAGCAACCCCTGGR：CACAGATGAGGGCACAAATG10CAN1308294F：GCTAATTACTTGCTCCGTTTTGR：AATGGGGGAGTTTGTTTTGG11Hpms1-694F：CGGTGGCATGTAGTTTCTGGAGR：AAGACATGAAATCCACAAGTTTTC12BM614614F：CTCATTACCACTTCATACAAAACAGR：TGCAGTAGGTGTTGCTACGG13CP100614F:ATCCCAAAAGGCAAAATCG:CCCTTCCACATTCAGTCA14CB1648975F：GGGACGTATTTTCGAAGAGGR：CTTCGCCTTGTTGACTAGGG15Hpms2-455F：CGAAAGGTAGTTTTGGGCCTTTGR：TGGGCCCAATATGCTTAAGAGC16CA5235586F：AATCCTCCAAATCCACCCTCR：ATTCGATTGCTTGCTCCTTG17AF2088346F:TGCACCAAGGTCCAGTAAGGTTGR:CCAACCACCATGGTTCATACAAG18hpms1-2747F:TCCCAGACCCCTCGTGATAGG:TCCGCTCCTTCCACAACTG19Hpms1-438F：AACCAGCAATCCCATGAAAACCR：GGGCTTTGGGGAGAATAGTGTG20CM108F：TTGGTTTTTGCTACTGGTAATR：AAACTGTCATATATTTGTGTGACT21CA5262118F:TTGGGGACTTCACGTCTCTCG:TTGATGATAAATCCTCCCCC22CA8474608F:ACGAGGCGCCCTCTCTCR:GAGTCCAAACTGAAGCTGCC23Hpms1-2818F：TGAGGCAGTGGTATGGTCTGCR：CCCGAGTTCGTCTGCCAATAG24Hpms2-2818F：TGAGGCAGTGGTATGGTCTGCR：CCCGAGTTCGTCTGCCAATAG25Hpms1-39F：TGGGAAATAGGATGCGCTAAACCR：AACTTTAAGACTCAAAATCCATAACC26Hpms2-419F：CTTCCCAGACCTCACTTTGTGGR：TCTTTGCGGTTATGTCAAGTGC27Hpms2-139F:TCACCTCATAAGGGCTTATCAATCG:TCCTTAACCTTACGAAACCTTGG28GP107810F：AGGGATATACGGTAACATCACR：TCGGTCTCTTCTATCTTATGA29CA52539011F：GGAAACTAAACACACTTTCTCTCTCR：ACTGGACGCCAGTTTGATTC30GP2003611F:TTTGGACCCTTTCCCTACR:GGATCAAGTAGGCGTTGA_________________________________5\nDB52/T953-2014